安装KaKs_Calculator3

KaKs_Calculator3的下载地址为：ngdc.cncb.ac.cn/biocode...

解压后，需要添加环境变量

安装ParaAT

ParaAT的下载地址为：ngdc.cncb.ac.cn/biocode...

ParaAT是一个整合工具，可以调用比对工具和KaKs

ParaAT.pl脚本较老，没有更新到适应KaKs_Calculator3，并且在使用muscle作为比对软件时需要muscle3，muscle v5的输入命令不适合

我一般将旧版muscle重新命名muscle3，因此我对ParaAT.pl做了以下修改：

line 136:

line 798：

line 732:解决同源簇中多个基因导致文件名过长的问题：

只取同源簇前两个基因名作为文件名（默认是全部基因名连接成文件名，很长！！！！）

准备输入文件开始分析实际操作中的问题（十分重要）：

1、在多基因同源簇计算时，直接使用ParaAT.pl -f axt -g -k参数调用kaks计算会直接将全部基因序列链接，软件则会认为是双基因比对，直接按照总长度除以2来计算长度。因此，在总长度为奇数时报错：Error. The size of two sequences in 'gene1&gene2' is not equal。就算不报错也是计算错误。因此，采用 -format clustal输出格式，然后使用KaKs_Calculator3自带的AXTConvertor转换成axt格式。此时得到的axt文件便是每对同源基因的分开结果，软件能够正确识别长度。

2、使用KaKs_Calculator3计算前需要使用cd-hit（参数：cd-hit -c 1 -d 0）将同源簇中的基因去重，否则KaKs_Calculator3计算缓慢，只要比对上区域一致性100%都会导致计算缓慢（速度可以相差200x），且重复的序列间本身不存在替换无结果，最终的ka，ks均为NA。因此cd-hit聚类时不需要限定覆盖度参数（-aL 1-aS 1）

3、如果将同一个同源簇的多个基因序列多序列比对，成一个multi-fasta文件，此时的序列比对是全局最优比对，但是任意一对同源基因却不一定是最优比对。因此，建议使用基因对比对结果，而不是多序列比对结果。所以在计算kaks之前，将同源簇中的多个基因转换成基因对形式，然后计算kaks。最后根据同源关系合并统计。此种方法结果较为准确，且不会出现not equal或者not code alignment的报错。

4、提供的序列文件CDS_file、protein_file的fasta文件需要序列ID行仅有ID不能有其他描述信息：

一个实际脚本：

将同源簇拆成基因对的脚本kaks_revision_para.py:

同源簇文件和序列文件来自于panaroo泛基因组结果