[人源化抗体]

· 20世纪80年代，由于重组DNA技术刚起步，只能通过少有的几种途径生产人源化单克隆抗体。比如通过将人的淋巴细胞和骨髓瘤细胞或其他的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞，将其大量克隆以生产人源单克隆抗体。这在当时虽然是个创新，但结果表明这种方法并不可靠，且产率低、易被污染。另一个限制其发展的因素是，融合所需的淋巴细胞是由患者正常生理过程产生的，先给予患者免疫实验性抗原后，从患者体内收集免疫后产生的淋巴细胞，这个过程被认为不符合人类社会的伦理道德规范。

· 随着基因工程技术的发展，可通过改变鼠抗体可变区的氨基酸残基，使之在不影响抗体结合活性的前提下，在序列、空间结构和各结构域的相互作用上更接近于人抗体分子。人源化抗体制备技术是建立在人们对抗体基因、结构和功能区域认识的基础上：

o 抗体分子是由2条轻链和2条重链组成的复合物，轻、重链的可变区形成抗原结合区(见图3-1)；

o 空间结构上可变区的结构相对独立于恒定区，恒定区的氨基酸改变对抗体结合抗原的能力影响较小(见图3-2)；

o 可变区由4个框架区和3个高变区组成，其中框架区的氨基酸比较保守，而高变区的氨基酸变化极大，又称互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)(见图3-3)，在抗体与抗原结合中发挥关键的作用，通常要予以保留。可变区除CDR区之外的框架区可以进行人源化替换，但是对于维持可变区结构的一些框架区鼠源氨基酸要予以保留，因为这些氨基酸的改变可能会改变可变区的空间结构，从而影响抗体结合抗原的能力。

· 制备人源化抗体的技术包括CDR移植技术(CDR grafting)、特异性决定簇残基(Specifity determining residue，SDR)移植、抗原表位定向选择、表面重塑、框架区更替等，其中CDR移植是应用最广泛的技术。

href="">· CDR移植

o CDR移植的抗体也称改型抗体，即用鼠源单抗V区中的CDR序列取代与其自身框架区(FR)最为相似的人源抗体中相应的CDR序列。

o 为了保证抗体可变区的空间结构，还需要将鼠源抗体框架区中对保持抗原结合位点的完整性很重要的氨基酸残基连同CDR区一起移植到人可变区的框架区上。

o 经过CDR移植，可能改变了单抗原有的CDR构型，其亲和力会下降甚至明显下降，但抗体的免疫原性大大降低。

o 虽然已能对抗体进行分子设计，在人源FR区引入鼠源FR区的某些关键残基(即回复突变)，如配置得当，其亲和力可与原有小鼠抗体的亲和力相当，但人化抗体常达不到原有鼠源单抗的亲和力。

o 回复突变是CDR移植后的关键步骤。直接CDR移植会导致重组抗体对靶抗原的亲和力或特异性降低，部分关键鼠FR区残基在调节CDR结构中发挥关键作用。在完成CDR移植后，需要将这些残基突变回鼠源的氨基酸，已恢复其亲和力。

· SDR移植

o 特异性决定簇残基(Specifity determining residue，SDR)移植是指CDR区中参与抗原抗体作用的关键氨基酸残基，占CDR区20%~33%，在各个抗体之间差异很大。

o CDR嫁接的人源化抗体仍可在患者体内引发免疫抗独特型反应，为了使抗可变区反应最小化，可以通过仅将特异性决定残基移植到人的FR区上实现抗体人源化，整体技术手段与CDR移植类似，往往也需要回复突变的辅助。

o SDR移植能够最大限度地减少抗体的鼠源序列，进一步减少了鼠源CDR中效应T细胞表位的数量来降低抗体的免疫原性，但是在抗体的亲和力保持上表现较差。

· 抗原表位定向选择

o 抗原表位定向选择(Epitope guided selection，EGS)和链更替法(Chain shuffling)是在噬菌体抗体库技术的基础上发展起来的人源化策略。

o EGS是以轻、重链基因可变区为基本单位，构建人重链鼠轻链及人轻链鼠重链杂合抗体库，利用噬菌体表面选择体系分别筛选出人重链鼠轻链基因及人轻链鼠重链基因，再将人轻、重链基因混合筛选获得与亲本鼠单抗识别相同表位的完全人源化的抗体轻、重链基因。

o 链更替法是在EGS基础上的改进，首先以鼠单抗的CDR3区基因替换人抗体库中的CDR3，构建含亲本鼠单抗CDR3基因的人源化噬菌体抗体库，再通过与亲本鼠抗体配对，依次进行抗体轻、重链替换，筛选到与亲本鼠单抗识别同一抗原表位人源抗体。

o 链更替法保留了抗体的主要结合区域，其结合活性更稳定。

o 但是无论是定向选择还是链更替均有可能造成改造后的单抗与亲本单抗的识别表位漂移，需要进行表位确证。

· 表面重塑

o 基于分子结构的表面重塑(Resurfacing)是直接基于抗体三维空间结构的人源化抗体技术，对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。

o 由于鼠源单抗V区的免疫原性大都源自该区域表面残基的运动性和溶液可及性，溶液可及性强的氨基酸可能具有较强的抗原性。

o 表面重塑技术强调以抗原抗体相互作用的精确或模建结构为依据，将鼠源的轻、重链可变区中表面可及性强的氨基酸残基用相应的人氨基酸残基替换，而保留鼠源的CDR区和被包埋的氨基酸残基。

o 该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区(CDR)构象的残基尽量不替换。

o 表面重塑技术可以最大限度地保留抗体的结合活性，同时提高其人源化程度，是比较理想的人源化方式。

· 框架区更替

o 框架区更替(Framework shuffling)与CDR移植抗体不同，这种方法不搜寻鼠源近似的人抗体框架区，而是根据人胚系基因，建立人抗体区框架库，再将异源抗体的6个CDR(轻、重链各3个)分别移植到人胚系基因的框架区上，相应的抗体组合库就可用抗原进行筛选。

o 这种方法不仅可以用于人源化抗体，而且是一种更为通用的抗体改造方法，通过筛选，甚至可能找到比亲本鼠源抗体更强亲和力的人源抗体。

· 目前FDA及中国食品药品监督管理总局(CFDA)批准的人源化单克隆抗体药物如表3-2所示。

[人源抗体]

· 人源抗体药物(Human monoclonal antibody drug)是通过细胞工程技术和基因工程技术制备的抗体序列全部是人源氨基酸的治疗性单克隆抗体药物。

· 20世纪90年代初建立了噬菌体抗体库展示技术，使在体外制备特异性抗体成为可能。为了进一步制备高亲和力的人源抗体，1997年美国Abgenix公司使用酵母人工染色体法(Yeast artificial chromosomes，YAC)等转基因技术成功地制备出含人免疫球蛋白基因的转基因小鼠Xenomouse；2001年英国剑桥大学Abraham Karpas教授从人多发性骨髓瘤细胞中筛选出了一株在体外具有稳定扩增能力的细胞株(Karpas707H)，可以与人B细胞发生融合，为筛选出由人类免疫系统所产生的最有效的治疗性抗体提供了基础，这些技术的建立使得人源单克隆抗体的制备成为可能。2002年，由英国剑桥抗体技术公司与美国雅培公司联合研制的第一个人源抗体阿达木单抗(Adalimumab)获美国食品药品管理局(FDA)批准上市。截至2014年，全球已有9个应用噬菌体展示文库及转基因小鼠技术制备的人源抗体药物被批准为肿瘤或自身免疫性疾病等的治疗药物。

· 基因工程人源抗体制备技术包括抗体库制备技术、转基因小鼠抗体制备技术、人人杂交瘤技术、EB病毒转化人B[淋巴]细胞技术和单个B细胞抗体制备技术等。目前，使用最多的是噬菌体抗体库展示技术和转基因小鼠抗体制备技术。抗体库制备技术的出现开创了一条简便、快捷的基因工程抗体生产路线，为人源抗体的制备开辟了新途径，是抗体工程史上的里程碑。抗体库制备技术主要包括噬菌体抗体库展示技术和核糖体展示技术，如阿达木单抗就是应用噬菌体抗体库展示技术制备的第一个人源抗体药物。

图1. 治疗性抗体的发展途径。

a.传统的小鼠杂交瘤技术首先用所需的抗原对小鼠进行免疫，以触发免疫反应。采集的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生持续分泌抗体的杂交瘤细胞。筛选后，选定的引线用于产生嵌合或人源化抗体。b.噬菌体展示。人类噬菌体显示的人类抗体文库用于选择感兴趣的抗原。经过3-5轮生物筛选，ELISA筛选免疫阳性噬菌体克隆；然后分析DNA序列以构建和表达人IgG。c.转基因小鼠。类似于小鼠杂交瘤技术或单B细胞方法。d.单B细胞技术。从受感染或接种疫苗的供体中制备PBMC，用流式细胞术分离合适的B细胞。

· 噬菌体抗体库展示技术的优点是不需要经过免疫系统和免疫步骤而直接得到人源抗体，但得到的抗体亲和力较低，需要进一步改造加强。

· 另一制备人源抗体的主要方法是转基因小鼠抗体制备技术，其优点是解决了抗体库技术中抗体亲和力不高的问题，缺点是转基因通常有体细胞突变和其他独特的序列，而且产生的单抗具有鼠的糖基化模式，因而也存在一定的副作用。已上市的戈利木单抗和帕尼单抗均由转基因小鼠抗体制备技术制备而成。

· 人源抗体药物具有高亲和力、高特异性、低排斥性的特点，已经成为治疗性抗体药物发展的必然趋势。但是人源抗体的研究仍有许多问题等待解决，比如，抗体亲和力的成熟、人源杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性、抗体的大规模生产等。随着其制备技术的完善和成熟，人源抗体必将成为当今以及未来生命科学及生物技术研究的热点和产业化的增长点。

· 人源抗体药物已用于临床治疗感染性疾病、肿瘤、器官移植、血液性疾病、变态反应性疾病、自身免疫性疾病等，如表3-3所示：

o 阿达木单抗为抗风湿疾病药物(Disease modifying antirheumatic drug，DMARD)，主要用于经治疗无效的中至重度成年患者类风湿关节炎、多关节型幼年特发性关节炎和全身型幼年特发性关节炎的治疗；

o 帕尼单抗主要用于治疗表皮生长因子受体表达阳性经化疗失败的结直肠癌；

o 戈利木单抗主要用于治疗中度至严重活动期类风湿关节炎、活动期银屑病关节炎和强直性脊柱炎(Ankylosing spondylits，AS)患者；

o 优特克单抗主要用于治疗银屑病关节炎及英夫利昔单抗治疗不佳的中、重度克罗恩病的治疗；

o 奥法木单抗主要用于氟达拉滨和阿仑珠单抗治疗无效的顽固性慢性淋巴细胞白血病的治疗；

o 地诺单抗主要用于预防实体瘤骨转移患者骨骼相关性事件；

o 贝利木单抗主要用于活动性、自身抗体阳性(系统性红斑狼疮)且正在接受目标治疗(包括类固醇皮质激素、抗疟药、免疫抑制剂和非甾体抗炎药)的狼疮患者；

o 易普单抗主要用于治疗晚期、无法手术的或转移性黑素瘤；

o 卡那单抗主要用于治疗儿童和成人冷吡啉相关周期性综合征；

o 雷莫芦单抗主要用于化学治疗失败的胃癌、胃食管连接处腺癌；

o 瑞西巴库用于预防和治疗吸入性炭疽病。

[几种常见人源抗体制备技术]

· 人类杂交瘤技术

o 人类杂交瘤技术允许以天然形式直接产生人类抗体，是生产天然治疗性和诊断性抗体最直接有效的方法，不需要额外的修饰，它被认为是最有前途和最方便的分离治疗单抗的技术平台。

o 然而，人类杂交瘤技术用于治疗目的的成功多年来一直受到限制，因为一些技术挑战，如无法获得人类融合细胞，因为大多数可用的融合细胞来自啮齿动物或异源骨髓瘤。人类B细胞与不同融合细胞的融合限制了这些单克隆抗体在治疗应用中的使用。几种异源骨髓瘤融合已成功用于生成人类来源的单克隆抗体，用于治疗不同的疾病，如HIV、基孔肯雅热、登革热等。然而，这种杂交瘤是不稳定，导致抗体分泌能力丧失，因此在分布、代谢和排泄方面，实现天然人抗体所需的药代动力学特征是一个挑战。

o 人类杂交瘤发展的另一个主要限制步骤是人类B细胞与骨髓瘤细胞的融合效率低(0.001%)，其次，外周血中循环抗原特异性B细胞的低百分比(0.01%)也限制了该技术的使用。抗原特异性B细胞的频率在血液循环中非常罕见，因此，选择合适的献血者对该方法的成功至关重要。急性感染患者比恢复期患者有更多的循环B细胞，高滴度的血清结合/中和抗体的供体可能有更高频率的外周B细胞，这表明成功产生杂交瘤的机会更大。

o 为了克服这些挑战，不同的研究小组尝试了EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒)转化方法来丰富B细胞群。最常用的细胞系B95-8是一种连续细胞系，在上清液中释放高滴度的转化EBV。B95-8细胞系是通过将绒猴血液白细胞暴露于EBV而启动的从人类白细胞细胞系中提取，B95-8为EBV从人类供体中建立连续淋巴细胞系提供了来源。EBV主要与外周血中含有CD21受体的细胞结合，外周血B细胞在其表面表达这些抗原，激活潜伏膜蛋白(latent membrane protein， LMP) 2A和LMP1。由于低抗体分泌和染色体不稳定的特点，转化的B细胞不能长时间培养。EBV向B细胞的转化效率较低，范围为0.1-1%，然而，加入CpG可以提高EBV病毒存在下B细胞的转化效率，CpG作为Toll样受体(TLR) 9激动剂。

o 用于融合的另外两种最常见的细胞系是SHM-D3327和HMMA 2.5，其中SHM-D3327是通过将人骨髓瘤细胞系FU-266，克隆E-1 (HAT敏感，8-azaguanine耐药，G-418(一种类似庆大霉素的抗生素)耐药)与小鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653融合产生。该细胞系已被用作融合细胞，以稳定分泌免疫球蛋白的淋巴母细胞样细胞系(LCL's)，以产生针对HIV-1和细小病毒B19包膜蛋白的单克隆抗体。

o HMMA 2.5是由小鼠骨髓瘤细胞系P3x6Ag8.653与IgA骨髓瘤患者骨髓单个核细胞融合而成的人×鼠细胞系，使用该细胞系作为骨髓瘤融合细胞已经产生了几种单克隆抗体。

o 人类杂交瘤发展的另一个限制因素是融合效率，融合主要通过三种方法进行(i)化学试剂，如聚乙二醇(PEG)； (ii)病毒介导方法；(iii)电融合方法。聚乙二醇介导的融合是最常见和最传统的融合方法，因为它简单，最常用的融合剂选择杂交瘤的生产。PEG介导融合的一个主要缺点是不同类型细胞之间产生非特异性融合。病毒制剂也被成功地用于两个不同细胞之间的融合，仙台病毒和水疱性口炎病毒是两种最常用的融合细胞病毒。最有效和创新的细胞融合方法是电细胞融合，这主要是基于细胞在高强度电场脉冲存在下的融合原理，导致瞬态膜渗透。该方法比化学或基于病毒的融合方法具有更高的融合效率，但是当融合细胞大小不同时电聚变的聚变效率很低。与其他骨髓瘤细胞相比，HMMA 2.5骨髓瘤细胞系是电融合的首选细胞系，其融合效率最高。

o 人类杂交瘤技术的主要优势在于，由于人类和啮齿动物免疫系统的差异，该技术产生的源自人类的抗体比源自啮齿动物的抗体具有更多的治疗应用。

· 单B细胞技术

o (A) 单个B细胞筛选方法。通常，ASC与这些技术一起使用，因为它们都依赖于分泌抗体。另外，激活记忆B细胞也可以使用。我们把方法分为开放试验和封闭试验。开放的检测方法包括Beacon (Berkeley Lights)技术、微流控室、微雕刻系统和微毛细管系统，封闭分析包括所有依赖于单个细胞包封在油包水滴的方法。开放和封闭技术主要依赖于抗原特异性抗体的检测，要么通过分泌抗体和表面显示抗原的小珠的共定位，要么通过不同荧光团的共定位或通过产生Förster共振能量转移(FRET)信号来检测抗IgG捕获的分泌抗体结合的可溶性抗原。

o (B) B细胞复制。原代B细胞被包裹在油包水液滴中，配对的VH-VL序列使用含有互补抗体恒定区序列的寡核苷酸在一个序列中扩增。为了做到这一点，细胞被裂解，VH和VL单个B细胞mRNA都被退火到被封装的寡核苷酸上。破乳后，通过RT-PCR制备文库，克隆成合适的表达载体，然后将这个文库转化为表达细胞，如酵母、噬菌体或哺乳动物细胞。获得的细胞群然后进一步用于常规的单细胞筛选，例如用荧光标记抗原或从这些单工程宿主细胞分泌的抗体的ELISA进行表面染色。

o (C) 单个B细胞分析(VH-VL配对)。原代B细胞被包裹在带有条形码寡核苷酸的Bead上，随后被裂解，使寡核苷酸与单细胞总mRNA一起退火。在乳剂破裂后，这些寡核苷酸被扩增并准备用于下一代测序。经过数据分析，抗体克隆的选择主要基于克隆型扩增(特别是VH-VL配对)，但也可能考虑其他特征。然后合成扩增最多的克隆(或考虑到其他特征)的抗体序列，克隆到合适的质粒中，并产生重组单克隆抗体；然后用ELISA等常规技术进行检测。

· 噬菌体展示技术

o 在噬菌体展示方法中，构建由可变重链和轻链抗体文库组成的大型组合文库，并与噬菌体表面涂层蛋白之一融合表达以展示，而抗体的基因则包含在噬菌体颗粒中，这种策略允许从原核系统的单个文库中分离出针对所需抗原的合适抗体。

o 基于噬菌体的展示不是直接受体内免疫反应的影响，然而，宿主免疫系统间接参与构建抗体库，用于噬菌体展示选择。

o 噬菌体展示广泛用于体外抗体筛选和选择，它可用于发现针对大多数种类抗原的抗体，以及针对可能在体内被免疫系统抑制的最广泛的表位集合的抗体，也可用于针对可能不暴露于免疫系统的靶标的抗体。

o 抗体噬菌体文库技术选择了多种形式的抗原结合片段，包括抗原结合片段(Fab， H链和整个L链的可变结构域和第一恒定结构域)、单链可变片段(scFvs， H链和L链的可变结构域，由柔性肽连接物连接)、单链抗体(sAbs，可变结构域，主要是H链)。

o 作为抗原结合片段，Fab是最早的单抗片段，它由轻链和重链的N端组成，一个链间二硫键将这些链连接在一起。

o scFv分子质量约为27 kDa，仅含有抗原结合位点，由VL和VH组成，VL和VH通过柔性肽连接在一起。无论蛋白浓度如何，柔性连接都能确保scFv的稳定性。与Fab和IgG相比，scFvs具有更小的尺寸和更高的扩散速率，这有助于它们更快地穿透和侵入肿瘤。此外，加速的血液清除(半衰期短)和在非靶组织中的低滞留时间使其更适合体内成像应用。Fab片段表达较差，但往往比scFvs更稳定。

o sAbs分子量约为12-15kda，是一种小的单体抗原结合结构域，sAbs的两种最显著的形式是VHH(仅重链抗体的骆驼源重链结构域)和VNAR(鲨鱼IgNARs的可变结构域)。VHH和VNAR虽有相似之处，但其结构略有不同。

o VHH的结构由两个β片组成，一个β片含有5个β链，另一个含有4个β链，在β链之间，它们有三个Ag结合环，框架区(FR) 1内的Cys23和FR3内的Cys94之间的保守二硫键连接了这些β-折叠片。VHH的paratope区包含三个CDR，其中CDR3在指定和抗原识别中起主要作用，CDR1和CDR2在结合强度中起作用，框架残基在抗原相互作用中起作用。

o VNAR由2个β-折叠片和8个β-链组成，FW2-CDR2的缺失导致VNAR包含CDR1和CDR3。与传统抗体相比，这些抗原结合片段平均含有更大的互补决定区(CDR)，可能是为了弥补可变轻链结构域CDR的缺失。

o 根据抗体基因序列的来源，可以区分出三种不同类型的抗体噬菌体文库：免疫抗体、naïve抗体和合成抗体文库。

o 对于免疫抗体文库，从免疫的人或动物B细胞的IgG mRNA中获得V基因(来自重链和/或轻链的可变区基因)，从中可以检索到针对多种表位的多种抗原结合物，这种文库是由免疫动物、感染或康复患者外周血或淋巴结中的淋巴细胞构建的。此外，免疫动物的B细胞也可以作为产生免疫噬菌体的来源具有生物技术、诊断或治疗应用的重要抗原库。同样采用转基因小鼠技术，含有大量的人类免疫球蛋白基因，同时其自身产生的内源性基因已被敲除，也可用于与人类癌症靶点甚至人类癌细胞进行免疫，诱导免疫应答。最后，羊驼也可以用来免疫人类靶标，然后克隆免疫的scFv或Fab库，羊驼的VH和VL基因与人类的VH和VL基因具有高度的序列一致性。因此，这些免疫库适合于检索“类人”抗原特异性结合物，这些结合物可以在治疗性IgG中重组。免疫的scFv或Fab文库有一个缺点：在免疫过程中，VH和VL亲和成熟成一对，而在克隆过程中，VH和VL大部分时间是通过PCR分别扩增，然后在scFv或Fab结构中随机重组。因此，亲和成熟的优势已经丧失，VH和VL在可能混杂配对后，希望功能对能够恢复。VHH很容易从相对较小的免疫文库中检索到，重组VHH被称为纳米抗体，因为其尺寸在纳米尺寸范围内。纳米抗体非常稳定，并且与人类VH具有很大的序列一致性。此外，如果有必要，它们很容易人性化，并且行为严格单一。

o 在naïve文库中，V基因通常是从多个健康的、未免疫的供者的B细胞的IgM mRNA中获得的，小(10^7-10^8)和大(10^10-10^11)的naïve文库分别产生uM到nM亲和力的抗体。为单克隆抗体分离而创建的大型naïve库的例子包括Hust及其同事创建的DYAX Fab库或HAL scFv库，剑桥抗体技术(CAT)和XOMA scFv和Fab库构建的scFv库。

o 第三类抗体文库是合成文库，它可以是完全合成的，也可以是天然序列和合成序列的组合(即半合成文库)。半合成文库有两个来源：来自前B细胞的非重排V基因(即种系V基因)或抗体框架，其中最多6个CDR(互补决定区)或至少CDRH3中的密码子通过诱变寡核苷酸随机化并克隆到抗体框架中。在合成文库中，随机的CDR区域插入到完全合成的框架序列中，合成抗体库的理论大小可以非常大，远远超过10^15个，合成抗体库通常产生sub nM(亚纳摩尔)亲和力的抗原特异性抗体。自体抗原靶向来自天然免疫系统的naïve B细胞通常是耗尽的，然而，对于合成文库，这种限制不应该存在。因此，合成文库和半合成文库都用于筛选自身抗原靶向抗体。

图2. 噬菌体展示纳米体选择示意图。

从免疫骆驼血分离淋巴细胞中提取mRNA，这些B细胞的mRNA经PCR扩增转化为cDNA。将PCR扩增产物连接到噬菌体载体上。为了构建VHH文库，将连接的DNA材料转化为大肠杆菌。用于感染细胞的M13辅助噬菌体。这些被感染的细胞产生了与尖端蛋白III融合的Nb蛋白噬菌体颗粒，它们也在病毒粒子内产生了具有Nb编码序列的噬菌体颗粒。这些病毒粒子与固定抗原在免疫管中孵育，去除非结合和多余的噬菌体颗粒，经过连续的生物筛选，通过ELISA鉴定出靶向特异性Nbs。

· 转基因小鼠抗体制备技术

o 转基因小鼠制备全人源抗体的实验原理是：在抗体生成过程不是从普通小鼠开始，而是从鼠抗体生成基因被相应人基因所取代的小鼠开始。该方法要求人的抗体基因片段在小鼠体内必须进行较为有效的重排与表达，并且这些片段能与小鼠细胞的免疫系统信号机制相互作用，使得小鼠在受抗原刺激后，这些人抗基因片段能被选择，表达并活化 B 细胞分泌人抗体。

o 其基本方法是采用在鼠胚胎干细胞(ES)中的同源重组来使得鼠原有基因缺失，再通过显微注射等技术将重建的人源抗体胚系基因微位点转入小鼠体内，最终由 mAb的杂交瘤分泌出全人序列的抗体。

o 转基因小鼠制备全人源抗体的主要优点是，其功效要优于其他生产抗正常人体蛋白mAb 技术，小鼠识别抗原和动员抗该抗原的抗体系统仍保持完整，容易把人体蛋白识别为异物；而且，由于抗体是在体内产生，经历正常装配和成熟过程，从而保证成品具有较高的靶结合亲和力。另一方面，用转基因小鼠生产候选mAb 药物时间较短，费用较低。

o 转基因小鼠技术目前主要存在以下几个问题：一是免疫耐受的问题， 虽然可以通过免疫佐剂的使用和免疫方法的改进来提高免疫反应强度，但对于一些人类抗原仍然较难获得高亲和力抗体； 二是上述提到的存在鼠源抗体干扰的问题； 三是存在对毒性抗原较难进行免疫等问题。

o 常用的技术方法包括原核显微注射法、逆转录病毒载体法、精子介导法和酵母人工染色体法。

o 原核显微注射法：该法又称 DNA 显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到 DNA 中，再通过胚胎移植技术将转基因胚胎移植到代孕受体动物子宫中，经过体内发育获得转基因动物。该方法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达 200kb，较少产生嵌合体等。它可以直接获得纯系，所以实验周期短。然而该方法有一些缺点使其很难在大动物中广泛应用：(1)显微操作仪器昂贵；(2)技术操作复杂，要求经过专门训练的技术人员操作仪器；(3)显微注射导入的外源基因在基因组中随机整合，可能导致内源性功能基因突变或者激活一些致癌基因，无法调控外源基因在基因组中的整合数目(拷贝数)；(4)外源基因整合效率较低，构建转基因大动物成本较高；(5)只能实现目的基因的整合，不能进行基因敲除研究。尽管如此，在体细胞核移植技术出现前，显微注射法是被广泛使用和效果最好的转基因技术。

o 逆转录病毒感染法：是最早被用于制备转基因动物的方法，常用的病毒载体包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。该方法首先将目的基因片段克隆至病毒载体的长末端重复序列(Long terminal repeat，LTR)的下游，利用病毒系统将含有目的基因的载体包装成高滴度的病毒颗粒，以该病毒颗粒侵染动物受精卵或者胚胎， 也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组 DNA中去。这种逆转录病毒被用重组 DNA 技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中， 或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的 DNA 的胚胎率高。但是逆转录病毒载体具有感染宿主较窄，产生嵌合体动物的概率高等缺点，限制了其在转基因动物制备中的应用。随着病毒载体的发展，目前慢病毒载体逐渐成为病毒载体法的主导方法。与一般的逆转录病毒载体法相比，慢病毒载体法具有感染宿主范围广，可感染几乎所有类型的细胞(分裂细胞和非分裂细胞)，一般对细胞的感染力可达 90%以上，具有较强的基因组整合能力。外源基因整合进入基因组织，可以稳定遗传。但是慢病毒自身有潜在的致癌性，安全性有待提高，病毒载体容量不够大，目前只能插入小于 10kb 的外源基因。

o 精子介导法：近年来利用精子作为外源基因的载体来建立转基因动物极为令人注目。其方法就是将成熟的精子与外源DNA进行预培养之后， 使精子有能力携带外源 DNA 进入卵子中， 使之受精， 并使外源DNA 整合于染色体中。精子携带DNA 主要是通过三种途径来完成， 即将外源 DNA 与精子共孵育、电穿孔导入法和脂质体传染法。该方法简单、方便， 依靠生理受精过程， 免去了原核的损伤。1989 年 Lavitrano 等首次利用小鼠附睾精子与DNA温育产生转基因小鼠，转基因效率高达 30%，外源基因稳定整合到生殖细胞中， 由此获得了转基因株系。所以这些引起了广大科研工作者的极大兴趣， 以精子作为载体、针对不同动物品种的研究工作相继展开。

o 酵母人工染色体法：YAC 系统是 1987 年发展起来的。该技术主要是将未重排的人类免疫蛋白胚系基因，首先构建成酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)，并把其转人小鼠即可获得分泌人抗体的转基因鼠。Mendez 等采用改进的细胞融合法：去掉含有 YAC 的酵母细胞壁，使其球状原生质与鼠胚干细胞(ES 融合)，然后把整合有目的基因的ES细胞导人小鼠囊胚，使之发育为嵌合体小鼠，再通过转基因鼠间反复交筛选，最终可获得分泌完全人抗体的小鼠。分别以人白细胞介素-8(IL-8)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和淋巴细胞表面抗原(CD4)等抗原免疫该鼠，再取其脾细胞以杂交瘤技术与鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选获得针对上述抗原的分泌高效价人抗体的杂交瘤细胞株。该技术明显优于微基因重组法，所获抗体的亲和力显著提高；但由于大量Ig 相邻基因片段的同源重组过程复杂，以及包含所有 Ig 恒定区基因的 YAC 克隆困难，到目前还不可能把所有人Ig 基因转入小鼠，故产生的抗体类型有限，仅能产生 IgM 和 IgG2。

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